Mengapa ruangan pada laboratorium kultur jaringan harus dalam keadaan aseptik?

TEKNIK ASEPTIK

I.       Pendahuluan

            Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali. Konsep awal dari kultur jaringan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril.

Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Sterilisasi pada teknik kultur jarngan meliputi: Sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat dan media dan sterilisasi bahan tanam. Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan pun harus dalam kondisi aseptic. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut mutlak dilakukan terutapa pada ruang penabur atau tempat yang digunakan untuk penanaman eksplan.

Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptik, bebas dari bakteri, jamur, yeast dan jasad renik lain pada setiap tahapan kegiatannya. Tehnik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kultur jaringan. Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Hambatan utama keberhasilan pelaksanaan kultur jaringan adalah adanya kontaminasi yang dapat timbul baik selama prosedur tersebut dikerjakan maupun selama kultur dipelihara didalam ruang inkubator. Kontaminasi oleh mikroorganisme menjadi problem yang sangat serius, karena mikrobia kontaminan akan segera mengkonsumsi zat hara yang ada pada medium kultur.

Mikroorganisme ini meskipun berukuran sangat kecil, tetapi jumlahnya sangat banyak dan aktivitas metabolismenya sangat tinggi, jika pertumbuhannya tidak dapat dicegah maka dalam waktu yang relatip singkat segera mendominasi kultur. Sel dan jaringan tanaman yang dikulturkan akan mati, matinya eksplan dapat disebabkan karena dibebaskanya senyawa-senyawa toksik sebagai hasil metabolisme dari mikrobia kontaminan, dapat juga karena eksplannya "dimakan" oleh mikrobia kontaminan tsb.

Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang menempel di permukaan eksplan. Peralatan yang akan digunakan untuk kultur jaringan harus sisterilkan terlebih dahulu.

Kontaminasi dapat timbul pada setiap tahapan dari pelaksanaan kultur jaringan, prosedur kerja aseptis yang harus dikerjakan untuk menanggulangi kontaminasi adalah:

1. Sterilisasi ruang kerja

2. Sterilisasi medium dan alat-alat

3. Sterilisasi eksplan.

II.      Pembahasan

STERILISASI RUANG KERJA, MEDIUM, ALAT-ALAT DAN EKSPLAN

Sebagaimana telah diuraikan pada Pokok Bahasan Laboratorium Kultur Jaringan, kegiatan aseptis dimulai didalam Ruang Steril dan Ruang Inkubasi /Kultur, kegiatan utama yang dilakukan meliputi sterilisasi dan penanaman eksplan diatas atau didalam medium kultur. Laboratorium sederhana setidaknya mempunyai dua ruangan tersebut, yang kebersihannya senantiasa harus diperhatikan. Ruang kerja yang kotor, akibat terlalu banyak orang yang lalu lalang didalamnya, dapat mengundang timbulnya kontaminasi. Ruang kultur yang tidak terpelihara dapat mengundang serangga-serangga kecil untuk masuk kedalam botol-botol yang berisi medium kultur.

Serangga-serangga kecil ini menimbulkan permasalahan tersendiri karena spora-spora jamur dan bakteri biasanya ikut lerbawa masuk kedalam botol kultur. Ruang kerja harus mudah dibersihkan dan dilengkapi dengan AC sehingga senantiasa kering dan sejuk.

Kegiatan sterilisasi medium dan alat-alat dikerjakan diruang persiapan. Kebersihan dan organisasi laboratorium yang efisien, ditunjang dengan peralatan yang memadai, dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali.

Sterilisasi ruang kerja

Ruang kerja yang digunakan untuk pekerjaan aseptis adalah ruang steril, ruangan ini harus senantiasa bersih, dinding dan lantai bersihkan setiap pagi dengan zat anti kuman / desinfektan. Udara didalam ruangan disterilisasi dengan lampu Ultra Violet (UV) yang kekuatannya disesuaikan dengan besarnya ruangan yang dipakai, lampu ini hanya dinyalakan jika ruangan tidak dipakai dan harus dimatikan ketika digunakan untuk bekerja. Radiasi UV tidak berbahaya bagi manusia karena tidak mengion, namun demikian harus diwaspadai karena dapat mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa tirnin pada satu rantai DNA. Penetrasi sinar UV utamanya pada bagian superfisial dari jaringan sehingga dapat melukai kulit dan retina mata.

 Sinar UV dapat menghasilkan ozon sehingga peneliti yang akan bekerja haras menunggu 15-30 menit setelah UV dimatikan, maksudnya supaya ozon tidak terhirup. Peneliti yang akan bekerja didalam ruangan ini haras memakai jas lab, masker dan tutup kepala, juga harus mencuci tangan dengan sabun antiseptik,kalau perlu menggunakan sarung tangan dari karet. Didalam ruangan ini terdapat alat-alat yang dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali, antara lain Laminar Air Flow dan stenl box (entkas).

·         Laminar air flow (laf).

Alat ini sangat baik dan efisien, namun harganya relatip mahal untuk menciptakan atmosfer yang steril dimana pekerjaan-pekerjaan aseptis haras dilakukan. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan hembusan udara yang sudah disaring (lihat gambar 1).

Gambar 2.1. Laminar air flow dengan bagian-bagiannya (a) udara masuk (b) blower (c) HEPA filter (d) ruang kerja aseptis (e) prefllter.

Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (high efficiency particulate air) filter dengan porositas 0,22 μm, spora-spora jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluar sudah suci hama, laf kadang-kadang dilengkapi dengan UV. Sebelum mulai bekerja, permukaan meja kerja laf disemprot dan dilap dengan kain yang telah dibasahi alkohol 70% atau spiritus, semua alat-alat dimasukkan ruang kerja (lihat gambar 2.2 detail ruang kerja).

Alat-alat dan medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya, untuk botol kultur yang berisi media, permukaannya disemprot atau dilap dengan alkohol 70%. Untuk laf yang dilengkapi dengan UV, sebelum bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan kontaminan pada permukaan ruang kerja.

Gambar 2.2 Detail ruang kerja dan Laminar air flow, botol berisi medium kultur dan alat-alat harus diletakkan dikanan kiri ruang kerja dan tidak boleh menghalangi hembusan udara steril.

Didalam laf juga sering dilengkapi dengan instalasi gas yang diperlukan untuk sterilisasi alat-alat dengan pembakaran, tetapi ini dapat diganti dengan lampu spiritus atau baktisinerator.

·         Steril box (entkas)

Alat lain untuk dapat menciptakan ruang kerja yang steril dengan harga yang relatip murah adalah steril box (entkas). Alat ini berujud seperti kotak yang terbuat dari bahan kaca (lihat gambar 4.3 ), plywood, papan kayu atau yang lebih sederhana misalnya dari kardus yang didalamnya dilapisi aluminum foil. Steril box atau entkas dapat dibuat dengan ukuran sesuai dengan yang dikehendaki, yang penting untuk diperhatikan adalah tangan kita dapat menjangkau setiap dinding entkas karena akan memudahkan untuk membersihkannya.

Gambar 2.3. Steril box (entkas) yang terbuat dari bahan kaca

Sebelum mulai bekerja, dinding entkas dibersihkan lebih dahulu dengan melap kain yang sudah dibasahi alkohol 70%. Ruang kerja didalam entkas disterilisasi dengan formalin tablet yang ditaruh didalam cawan porselin kecil dan diletakkan disudut-sudut ruangan, setiap cawan berisi satu tablet. Uap formalin ini dapat mensterilkan udara yang terdapat didalam entkas. Alat-alat dan botol kultur yang berisi media disemprot permukaannya satu persatu dengan alkohol 70% kemudian dimasukan kedalam entkas, dibiarkan 30 menit baru mulai bekerja.

 Pada entkas juga dapat ditambahkan lampu UV, entkas ini seluruh dinding luarnya harus ditutup dengan aluminum foil, hal ini diperlukan untuk menghindari mata dan kulit dari bahaya radiasi UV.

·         Sterilisasi media dan alat-alat

Media yang digunakan adalah untuk menumbuhkan eksplan. Media yang mengandung bahan-bahan yang tahan panas sterilisasinya dilakukan dengan pemanasan basah, menggunakan alat yang namanya autoclave, bekerjanya dengan tekanan uap. Standar teknis untuk Sterilisasi ini adalah pada temperatur 121°C, tekanan antara 15 - 17 psi dengan waktu antara 15-40 menit tergantung dari banyaknya media yang disterilisasi. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, sterilisasi dilakukan dengan tekanan 15 psi selama 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama.

Autoclave yang digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang paling sederhana sampai yang dapat diprogram (programmable). Autoclave sederhana pemanasan airnya menggunakan kompor gas, sedangkan pengaturan suhu tekanan dan waktunya dilakukan secara manual. Pada waktu mengoperasikan autoclave ini, jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum udara yang ada didalam autoclave diganti seluruhnya oleh uap air yang mendidih sehingga akan tercapai temperature 121°C ( langkah ini tidak dikerjakan untuk autoclave yang programmable).

Setelah waktu Sterilisasi selesai (15-20 menit) klep-klep pembuang dibuka pelan-pelan, tekanan uap didalam autoclave pelan-pelan akan sama dengan tekanan atmosfer, pembukaan klep pembuang yang tergesa-gesa akan mengakibatkan medium yang ada didalam botol kultur mendidih dan meluap. Alat lain yang mempunyai prinsip kerja mirip dengan autoclave adalah pressure cooker, alat yang biasa digunakan untuk memasak didapur ini kapasitasnya sangat terbatas, sehingga tidak dianjurkan untuk pekerjaan pada skala laboratorium karena tidak efisien.

 Autoclave yang paling modern adalah yang programmable, dapat diatur waktu, suhu dan tekanannya secara automatis sehingga dapat dijalankan sambi! mengerjakan pekerjaan yang lain.

Tabel 2.1. Lama waktu minimal untuk sterilisasi media

 (Biondi dan Thorpe, 1978)

Sterilisasi medium kultur dengan menggunakan autoclave mempunyai banyak kelemahan, antara lain:

1. Sukrosa akan terurai menjadi fruktosa dan glukosa

2. Penggunaan temperatur yang tinggi pada autoclave dapat mengakibatkan terbentuknya caramel gula yang berwarna coklat, merupakan racun didalam medium kultur

3. Sejalan dengan lamanya waktu sterilisasi, pH medium dapat mengalami perubahan, terjadi pengendapan garam-garam dan depolimerisasi agar.

Beberapa komponen medium ada yang tidak stabil kalau kena panas yang tinggi, misalnya GAs, Ca-panthothenate dan Thiamin-HCl harus disterilisasi dengan ultra filtrasi (Millipore filter) pada suhu ruangan (25°C). Dengan memakai ultrafiltrasi larutan yang berisi bahan-bahan yang termolabil dimasukkan kedalam medium kultur yang telah steril, langkah ini dikerjakan didalam ruang steril (laf) ketika medium agar telah agak dingin tetapi belum memadat.

Ada beberapa macam Millipore filter, yang terbuat dari polyethylene film sekali pakai terus dibuang (disposable), ada Millipore filter yang dilengkapi dengan holder , filter holder ini dapat disterilisasi dengan autoclave (autoclavable). Porositas dari filternya juga bermacam-macam, mulai dari 0,22 - 0,45 μm. Untuk larutan termolabil dalam jumlah sedikit (5-50 ml) dengan mudah dapat disterilisasi dengan Millipore filter yang dipasang pada ujung syrink (alat suntik). Dalam jumlah besar (50 - 5000 liter) sterilisasi dengan ultrafiltrasi ini harus dibantu dengan pompa vakum.

Alat-alat yang digunakan didalam ruang steril antara lain : scalpel, pinset bermacam-macam ukuran, petridish, cork borrer, pipet, alat-alat gelas (botol kultur dsb), gunting, kertas saring dsb. Alat-alat tersebut, sebelum disterilisasi, dibersihkan terlebih dahulu kemudian dibungkus rapi dengan kertas coklat. Alatalat yang akan disterilisasi dengan autoclave tidak boleh dibungkus dengan aluminum foil sebab uap air tidak dapat masuk kedalam bungkusan. Untuk botol kultur, sebelumnya harus dicuci kemudian ditutup dengan aluminum foil atau

bahan lain yang terbuat dari karet, kain atau plastik yang tahan panas. Botol kultur dengan penutup yang berulir, tidak boleh ditutup terlalu rapat ketika disterilisasi, ini diperlukan agar tidak terjadi perbedaan tekanan dengan ruangan didalam autoclave, perbedaan tekanan akan mengakibatkan pecahnya botol kultur.

·         Sterilisasi eksplan

Eksplan adalah bagian kecil dari tanaman baik itu sel, jaringan, ataupun organ yang digunakan untuk memulai suatu kultur. Eksplan yang digunakan didalam kultur jaringan harus yang masih muda (primordia), sel-selnya masih bersifat meristematik. Sel-sel yang bersifat meristematik dicirikan dengan sifatnya yang selalu membelah, selnya berukuran kecil tetapi inti selnya relatip besar, penuh plasma, vacuola kecil-kecil, dinding sel tipis terdiri dari dinding primitip yang berupa selulosa microfibril. Bagian tanaman yang bersifat meristematik antara lain terdapat pada ujung (kuncup) batang atau akar, dikenal dengan nama

meristem apikal, pada batang disebut shoot apical meristem sedangkan meristem yang terdapat pada kuncup diketiak daun disebut meristem aksiler (gambar 2.4).

Gambar 2.4. Tanaman dikotil dengan kuncup apikal dan aksiler dimana didalamnya terdapat sel-sel yang meristematik.

Bagian tanaman yang bersifat meristematik seringkali terdapat dalam keadaan terbuka sehingga kotoran dan berbagai kontaminan seringkali menempel pada bagian permukaannya. Kontaminan ini dapat berupa bakteri, jamur dan spora-sporanya, serangga dan telur-telurnya, protozoa dsb. Keadaan ini terutama dijumpai pada tanaman donor yang tumbuh dilapangan.

Kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptis yang terkendali, jika kontaminan ini tidak dihilangkan maka medium yang mengandung banyak nutrisi akan dengan cepat dipenuhi oleh mikrobia kontaminan tersebut. Untuk mengurangi adanya kontaminan pada permukaan eksplan, tanaman donor sebaiknya ditanam didalam rumah kaca. Pada beberapa jenis tanaman seperti ketimun dan umbi akar wortel, seringkali dijumpai adanya kontaminan internal yang terdapat didalam jaringan tanaman. Kontaminan internal ini sangat sulit untuk diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak akan efektip.

Eksplan yang digunakan ukurannya sangat bervariasi dari yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikroskopis) misalnya mikrospora, shoot apical meristem, embrio dsb sampai yang berukuran 1 cm atau lebih misalnya ruas batang, daun, hipokotil, biji, rhizom dsb. Bagian-bagian tanaman tersebut seringkali masih tertutup oleh jaringan / sarung-sarung daun misalnya pada daun tebu, hal ini akan memudahkan prosedur sterilisasi karena secara alamiah bagian daun yang ada didalamnya masih suci hama.

Eksplan yang berukuran terlalu besar akan membawa resiko kontaminasi yang lebih besar, namun jika digunakan eksplan yang terlalu kecil pertumbuhan dan respon yang diharapkan juga tidak sebaik jika menggunakan eksplan yang berukuran besar. Dilema ini menyebabkan tidak adanya metoda sterilisasi eksplan yang baku untuk semua tanaman. Hal penting yang harus diperhatikan pada sterilisasi eksplan adalah bahwa eksplan dan mikrobia kontaminan keduanya adalah jasad hidup, kontaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan eksplan.

Bahan pensteril yang umum digunakan untuk sterilisasi eksplan adalah calcium hypochlorite , sodium hypochlorite, sublimat/mercuric chloride (HgCl2), alkohol dsb. Konsentrasi dan lama waktu sterilisasi sangat bervariasi tergantung dari jenis eksplan dan tempat tumbuhnya. Eksplan yang ditumbuhkan dalam rumah kaca relatip lebih bersih, sedangkan yang berasal dari lapangan pada umumnya lebih kotor, lebih terkontaminasi sejak dari awalnya sehingga prosedur sterilisasi harus dibuat lebih keras dengan meningkatkan konsentrasi bahan pensteril atau dengan memperpanjang waktu sterilisasi.

Semua bahan-bahan pensteril adalah toksik terhadap eksplan, sehingga perlu dilakukan pencucian yang berulang-ulang agar semua bahan pensteril yang menempel dapat tercuci. Untuk meningkatkan penetrasi bahan pensteril, seringkali ditambahkan 1 atau 2 tetes agensia pembasah ( Triton-X , Tween 20 atau Tween 80) yang fungsinya menambah tegangan pada permukaan eksplan. Penggunaan pompa vakum juga dapat meningkatkan penetrasi bahan pensteril pada permukaan jaringan sehingga dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi.

Tabel 2.2 Efektifitas beberapa bahan pensteril

Bhojwani & Razdan, (1983)

Pra-sterilisasi dengan mencuci eksplan menggunakan sabun/detergent dan dibiarkan beberapa saat dibawah pancuran air yang mengalir selama 15-30 menit juga diperlukan untuk memecah koloni kontaminan agar lebih peka terhadap bahan pensteril. Bahan yang sudah bersih dikecilkan ukurannya kemudian dibawa kedalam ruang steril untuk disterilisasi lebih lanjut. Untuk sterilisasi eksplan kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan pensteril, misalnya direndam didalam larutan sodium hypochlorite kemudian dicuci dengan air steril dilanjutkan dengan perendaman didalam larutan sublimate dan pembilasan dengan air steril.

            Untuk eksplan yang berdaging (umbi kentang, wortel), eksplan yang tertutup sarung daun (pucuk tebu), dan biji muda yang masih terdapat didalam buah (anggrek) dapat disterilisasi dengan merendam didalam alkohol beberapa saat, kemudian dilewatkan diatas nyala api dan dibiarkan sampai nyala api padam, cukup efektif untuk membawa kultur bebas dari kontaminasi.

JENIS-JENIS STERILISASI

Menurut Tim Penyusun Praktikum Mikrobiologi tahun 2011, sterilisasi ada dua jenis yaitu:

1. Sterilisasi dengan cara fisik

 A. Pemanasan Air dan uap adalah media panas yang baik.

 Dalam waktu relatif singkat, alat yang akan disterilkan akan mencapai suhu yang diinginkan. Udara adalah penyalur panas yang kurang baik. Oleh karena itu, untuk mecapai suhu yang diinginkan akan membutuhkan waktu yang cukup lama.

1. Panas kering.

Cara ini untuk membunuh mikroba hanya memakai udara panas kering yang tinggi. Sterilisasi panas kering dibedakan atas :

a. Panas membara Dengan jalan menaruh benda yang akan di sterilkan dalam nyala api bunsen sampai merah membara. Alat yang disterilkan yaitu sengkelit, jarum, ujung pinset dan ujung gunting.

b. Melidah - apikan Dengan melewatkan benda dalam api bunsen, namun tidak sampai menyala terbakar. Alat yang disterilkan yaitu scalpel, kaca benda, mulut tabung dan mulut botol.

c. Udara kering Oven merupakan ciri umum yang dimaksud. Alat ini terbuat dari kotak logam, udara yang terddapat di dalamnya mendapat udara panas melalui panas dari nyala listrik. Alat yang disterilkan yaitu tabung reaksi, cawan petri, pipet, scalpel dari logam, gunting dan botol. Pemanasan satu jam dengan temperatur 160 oC paling cepat 1 jam tapi lebih baik 2 jam. Suhu ini digunakan secara khusus untuk sterilisasi minyak lemak atau cairan anhidrat lainnya.

2. Panas Basah.

Yang dimaksud panas basah adalah pemansan menggunakan air atau uap air. Uap air adalah media penyalur panas yang terbaik dan terkuat daya penetrasinya. Panas basah mematikan mikroba. Oleh karena koagulasi dan denaturasi enzim dan protein protoplasma mikroba. Untuk mematikan spora diperlukan panas basah selama 15 menit pada suhu 121 oC. Sterilisasi panas basah dapat dibedakan atas tiga golongan yaitu:

a. Panas basah <100 oC (Pasteurisasi).

Pasteurisasi yaitu pemanasan pada suhu 60 oC selama 30 menit. Pasteurisasi tidak dapat membunuh spora atau dipanaskan pada suhu 71,6 – 80 oC selama 15 – 30 detik kemudian cepat – cepat didinginkan.

b. Panas basah pada suhu 100 oC.

Di sini menggunakan air mendidih (suhu 100 oC) selama 10 menit. Untuk mematikan bentuk spora dilakukan pemansan 3 hari berturut – turut selama 15 – 45 menit sehingga spora yang tidak mati pada pemanasan pertama akan beruah menjadi bentuk vegetatif pada hari kedua steleh inkubasi pada shu 37 oC begituu pula spora yang tidak mati pada hari kedua, akan berubah menjadi bentuk vegetatif pada hari ketiga.

Metode ini jarang memuaskan untuk larutan yang mengandung bahan-bahan karena spora sering gagal tumbuh di bawah kondisi ini, bentuk vegetatif dari kebanyakan bakteri yang tidak membentuk spora,.

c. Panas basah >100 oC.

Sterilisasi dengan cara ini hasilnya mutlak steril, sehingga biasa dipergunakan di rumah sakit dan laboratorium besar. Cara ini menggunakan tangki yang diisi dengan uap air yang disebut autoclave. Alat yang disterilkan adalah alat dari kaca, kain kasa, media pembenihan, cairan injeksi, dan bahan makanan. Kerugian yang paling prinsip dari penggunaan uap ini adalah ketidaksesuaiannya untuk penggunaan bahan-bahan sensitif. Dalam waktu ½ menit pada suhu 120 oC dapat menghancurkan spora vegetatif yang tahan terhadap pemanasan tinggi.

B. Filtrasi / Penyaringan

Penyaringan dilakukan dengan mengalirka larutan melalui suatu alat penyaringan yang memiliki pori – pori cukup kecil. Untuk menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan yang umum digunakan tidak dapat menyaring virus. Penyaringan dilakukan dengan untuk mensterilkan cairan yang tidak tahan terhadap pemanasan dengan suhu tinggi seperti : serum, larutan yang mengandung enzim, toksin kuman, ekstrak sel, antibiotik dan asam amino.

Terdapat beberapa macam filter :

1. Filter seitz, digunakan dari bahan asbes yang dijepitkan pada dasar wadah besi, keuntungan dari filter ini adalah lapisan filter yang dapat di buang setelah digunakan dan masalah pembersih hanya berkurang. Filter ini mampu dengan volume dari 30 ml hingga lebih dari 100 ml, kerugian pertama dari filter ini adalah cenderung memberikan komponen magnesium pada filtrat kedua permukaan saat lapisan filter membuat larutan tidak cocok untuk injeksi.

2. Filter swinny, filter ini mempunyai alat khusus yang terdiri dari lapisan asbes, bersama dengan screen dan pencuci, utamanya untuk digunakan filter swinny dibungkus dengan kertas dan di autoclaf. Bagian yang dipasang dihubungkan pada spoit luer lola dan cairan dimasukkan melalui disk asbes dengan menggunakan tekanan pada saluran spoit.

3. Filter fritted-glass, disusun dari dasar serbuk, tombol bulat dari gelas digabung bersama dengan penggunaan panas untuk menentukan sebelumnya ukuran dalam bentuk disk.

4. Filter Berkefeld dan Mendler,  tes bentuk tube filter pembanding ini yang dihubungkan dengan dasar logam dan saluran keluar tube adalah sama pada keduanya. Dibuat dari silikat murni, asbes dan kalsium sulfat.

C. Radiasi / Penyinaran

Sinar ultraviolet umumnya digunakan untuk mengurangi kontaminasi di udara dan pemusnahan selama proses di lingkungan, aksi letal ketika sinar UV melewati bahan, energi bebas ke elektron orbital dalam atom-atom dan mengubah ke area kereaktifannya. Mikroorganisme dapat dibunuh dengan penyinaran yang memakai sinar ultrraviolet yang panjang gelombangnya antara 220 – 290 nm. Radiasi paling efektif adalah 253,7 nm. Sinar matahari langsung mengandung sinar ultraviolet 290 nm, sehingga sinar matahari adalah sinar yang bersifat bakterida yang baik.

2. Sterilisasi Dengan Cara Kimia

Zat kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi dapat berwujud :

a. Gas : Ozon, formaldehyde, ethylene oxide gas

b. Larutan : deterjen, yodium, alcohol, peroksida fenol, formalin, AgNO3 dan merkuroklorid.

            Sterilisasi dengan cara kimia antara lain dengan disenfektan. Daya kerja antimikroba disenfektan ditentukan oleh konsenntrasi, waktu dan suhu. Beberapa contoh desinfektan yang digunakan antara lain : Desinfektan lingkungan misalnya :

1. Untuk permukaan meja : lisol 5%, formalin 4% dan alcohol.

2. Untuk di udara : natrium hipoklorit 1%, lisol 5% atau senyawa fenol lain

3. Desinfektan kulit atau luka : dicuci denngan air sabun, providon yodium dan etil alkohol 70%.

KEUNTUNGAN DAN KERUGIAN MASING-MASING METODE STERILISASI

1.Sterilisasi Panas Kering

Keuntungan:

1.Dapat digunakan untuk membunuh spora dan bentuk vegetatifnya dari semua mikroorganisme (Lachman: 1263).

2. Umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif disterilkan dengan uap air panas (Ansel: 413).

3. Metode pilihan bila dibutuhkan peralatan yang kering atau wadah yang kering seperti pada zat kimia kering atau larutan bukan air (Ansel: 414).

Kerugian:

1. Hanya digunakan untuk zat-zat yang tahan penguraian pada suhu diatas kira-kira 140oC (Lachman: 1263).

2. Karena panas kering efektif membunuh mikroba dengan uap air  panas, maka diperlukan temperatur yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang (Ansel: 413).

2. Sterilisasi Uap Panas

Keuntungan :

1. Adanya uap air dalam sel mikroba menimbulkan kerusakan pada temperatur yang relatif rendah daripada tidak ada kelembaban (Ansel: 412).

2. Metode ini digunakan untuk sediaan farmasi dan bahan-bahan yang dapat tahan terhadap temperatur yang digunakan dan  penembusan uap tetapi tidak timbul efek yang tidak dikehendaki akibat uap air (Ansel : 413).

3. Sel bakteri dengan kadar air besar umumnya lebih mudah dibunuh (Ansel : 413).

4. Dipergunakan untuk larutan jumlah besar, alat-alat gelas,  pembalut operasi dan instrument (Ansel :413).

5. Dapat membunuh semua bentuk mikroorganisme vegetatif (Scoville`s : 408).

Kerugian :

a. Tidak digunakan untuk mensterilkan minyak-minyak lemak, sediaan berminyak dan sediaan yang tidak dapat ditembus oleh uap air atau pensterilan serbuk terbuka yang mungkin rusak oleh uap jenuh (Ansel : 413).  

b. Spora-spora yang kadar airnya rendah, sukar dihancurkan (Ansel : 413).

3. Sterilisasi Gas

Keuntungan :

1. Beberapa senyawa yang tidak tahan terhadap panas dan uap dapat disterilkan dengan baik dengan memaparkan gas etilen oksida atau propilen oksida bila dibandingkan dengan cara lain (Ansel : 416)

2. Dapat digunakan untuk membunuh mikroorganisme dan spora lain (Parrot : 280).

Kerugian         :

1. Gas-gas (etilen dan propilen oksida) mudah terbakar bila tercampur dengan udara (Ansel : 417)

2. tindakan pengemasan yang lebih besar diperlukan untuk sterilisasi dengan cara ini daripada dengan cara lain karena waktu, suhu kadar gas dan kelembapan jumlahnya tidak setegas seperti sterilisasi panas kering dan lembap panas (Nasel : 417)

3. Gas-gas sulit hilang dan kebanyakan bahan-bahan setelah pemaparan (Lachman:1283)

4. Iritasi jaringan dapat terjadi jika etilen oksida tidak dihilangkan sama sekali, sifat karsinogenik dan mutagenic dari etilen oksida dari sisa-sisa pada bahan yang digunakan pada manusia (Lachman : 1285).

5. Waktu siklus untuk sterilisasi dengan etilen oksida agak lama (Lachman : 1286)

4. sterilisasi Dengan Penyaringan

Keuntungan     :

1. Penyaringan dapat digunakan untuk memisahkan partikel termasuk mikroorganisme dari larutan gas tanpa menggunakan panas (Lachman : 1285)

2. Saringan tidak harus mengubah larutan/gas segala cara (Lachman : 1265)

3. Tidak menghilangkan bahan yang diinginkan atau membawa komponen yang tidak diinginkan (Lachman : 1265)

4. Kecepatan penyaringan sejumlah kecil larutan, kemampuan untuk mensterilkan secara efektif bahan tahan panas (Ansel : 416)

5. Peralatan yang digunakan relatif tidak mahal dan mikroba hidup dan mati serta partikel-partikel lengkap semua dihilangkan dari larutan (Ansel : 416)

Kerugian         :

1. Penyaringan cairan dengan volume besar akan memerlukan waktu yang lebih lama terutama bila cairan kental dibandingkan dengan bila memakai cara sterilisasi lembap panas (Ansel : 414).

2. Cara ini diharuskan menjalani pengawasan yang ketat dan memonitoring karena efek hasil penyaringan dapat dipengaruhi oleh banyaknya mikroba dalam larutan (Ansel : 414)

3. Filter bakteri tidak efektif menghilangkan virus dari larutan (Scoville’s : 419)

4. Muatan dalam pH yang sesuai yang bersifat alkali menyebabkan keusakan filter dan partikel yang kecil merupakan problem yang khusus (Scoville’s : 419)

5. Tiap kebocoran yang mungkin terjadi pada sistem ini menyebabkan kerusakan pada bagian luar tanpa kontaminan filtrat yang steril (Lachman : 1282-1283).

6. Kesulitan mempertahankan kondisi aseptis seperti merupakan masalah besar sehubungan dengan sterilisasi melalui penyaringan (Lachman : 1283)

5. STERILISASI RADIASI

Keuntungan     :

            Pemakaian radiasi meningkat dalam frekuensi dan luasnya pemakaian setelah diperoleh pengalaman dengan metode ini, khususnya untuk sterilisasi alat medis, plastik, sejumlah vitamin, antibiotik, dan hormon dalam keadaan kering setelah berhasil dibuat steril dengan radiasi (Lachman : 1276)

Kerugian         :

1. Penggunaan tehnik ini terbatas karena memerlukan peralatan yang sangat khusus dan pengaruh radiasi dan produk-produk dan wadah-wadah (Ansel : 418).

2. sediaan farmasi dalam cairan tubuh lebih sulit disterilkan karena efek radiasi tehadap sistem zat pembawa dari jaringan obat (Lachman:1276).

APLIKASI

1.        Pengaruh tingkat sterilisasi terhadap keberhasilan proses kultur jaringan dapat kita lihat pada jurnal yang berjudul “Kultur Jaringan Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) : Pengaruh metoda Sterilisasi dan Komposisi Media” Jurnal Agronomi 9(2):99-102 oleh Myrna, N.

            Pada jurnal diketahui bahwa banyak ilmuan yang masih membiakkan jeruk nipis dengan menggunakan stek batang. Padahal dengan tehnik ini akan memberi peluang bagi tertularnya penyakit, terutama disebabkan oleh virus dari generasi ke generasi. Selain itu dengan penyetekan juga membutuhkan waktu yang cukup lama. Padahal jeruk ini memiliki nilai ekonomis yang cukup baik untuk daerah-daerah di Indonesia. Karena itu dilakukanlah tehnik Kultur jaringan terhadap perbanyakan tanaman jeruk nipis sehingga semua permasalahan diatas dapat diatasi.

Pada percobaan I

Tahapan ini dilakukan pengujian terhadap berbagai metoda sterilisasi bahan tanaman. Tanaman yang dimbil adalah eksplan pucuk tanaman jeruk nipis tanpa biji dari lapangan. Untuk memperkecil tingkat kontaminasi telah dipelihara intensif di rumah kaca dan diperlakukan dengan 0,5 g L-1 Benlate seminggu sekali selama 2 bulan.

·                Bahan Sterelisasi : Na-hipoklorit (0,1 M), Ca-hipoklorit (0,5 M) dan HgCl2 (1,0 M) dan 5,0% dilakukan perendaman 10, 20, dan 30 menit.

·                Prosedur : Pucuk bagian nodus dipotong dan direndam kemudian dikocok selama 10 menit dalam larutan 2 tetes Tween-20 per 100 mL air steril. Kemudian direndam dalam bahan sterilisasi dengan konsentrasinya selama 10, 20 dan 30 menit. Kemudian dibilas dengan air steril sampai bersih. Dalam laminar Flow Cabinet, eksplan dipotong kira-kira 1 cm dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Kemudian eksplan tadi ditanamkan pada medium pra kondisi.

·                Hasil : percobaan diatas memperlihatkan bahwa Ca dan Na-hipoklorit ternyata tidak efektif untuk digunakan dalam mensterilkan eksplan tanaman jeruk nipis asal lapangan. Hal ini terlihat pada semua eksplan pada percobaan I terkontaminasi jamur dan mati. Begitu juga dengan bahan HgCl2. Tapi bahan HgCl2 lebih baik dalam melakukan sterelisasi eksplan dengan perendaman yang lebih lama yaitu 30 menit.

Percobaan II

            Percobaan-2 ini adalah pengujian terhadap berbagai komposisi medium dasar. Bahan tanaman yang digunakan sama dengan pada percobaan I.

·           Komposisi medium dasar : MS dan MS1/2, Woody Plant Medium, B-5, LS dan SH. Masing-masing diperlakukan ulang sebanyak 10 kali.

·           Bahan eksplan yang digunakan sama seperti percobaan-1, yakni potongan nodus tunggal yang berasal dari pucuk muda.

·           Hasil : dari percobaan diketahui bahwa perlakuan beberapa komposisi media memperlihatkan adanya respon pertumbuhan yang dicirikan oleh terjadinya proliferasi kalus. Tapi media yang paling baik adalah MS dan MS1/2 sedangkan media yang keempat kurang tepat dalam pertumbuhan jeruk.

2.        Sterilisasi Umbi Wortel

Langkah-langkah sterilisasi untuk umbi wortel adalah sebagai berikut :

·           Umbi wortel dicuci bersih dengan detergen, kemudian disterilisasi secara fisik dengan pembakaran. Sebelum dibakar, umbi wortel terlebih dahulu dicelup dalam spritus sebanyak 3 kali.

·           Serilisasi dengan pembakaran ini umumnya sudah cukup, tetapi kadang-kadang umbi wortel tersebut masih perlu disterilisasi lagi dengan menggunakan 0,1 sublimat.

·           Cara sterilisasi eksplan wortel adalah sebagai berikut : umbi yang telah dibakar kemudian dikupas kulit luarnya. Pengupasan dilakukan dalam laminar air flow dalam kondisi steril. Umbi dipotong-potong selebar 2 cm dan dimasukkan dalam larutan sublimat sekitar tiga menit. Setelah itu, umbi wortel dicuci dengan air steril 3-4 kali untuk menghilangkan sisa sublimat yang masih menempel.

3.        Sterilisasi Biji Melon.

Langkah-langkah sterilisasi untuk biji melon adalah sebagai berikut :

·           Daun-daun melon yang masih muda dicuci dengan deterjen hingga bersih.

·           Sterilisasi dengan clorox 10% dan dua tetes tween 20 dan digojog selama 5 menit.

·           Cara sterilisasi lainnya dengan sublimat

·           Dibilas dengan air steril dan diulang 3-5 kali agar sterilan hilang dari permukaan daun.

Sterilisasi ini dilakukan di ruang penabur dan semuanya dalam kondisi aseptis.

4.        Sterilisasi Tanaman Kenanga

Khusus untuk tanaman kenanga dan tanaman berkayu lainnya tahap sterilisasi perlu dilaksanakan secar bertingkat untuk menjaga agar kontaminasi oleh jamur dan bakteri dapat ditekan serendah mungkin. Walaupun sudah dilaksanakan sterilisasi dengan berbagai cara, namun kadang-kadang kontaminasi tetap saja terjadi. Dalam hal ini mungkin pada eksplan tersebut telah terjadi kontaminasi internal sehingga meskipun bagian permukaan telah disterilisasi tetapi tidak efektif untuk kontaminasi yang berada di dalam sel atau jaringan tanaman.

Tahap-tahap sterilisasi terhadap tanaman kenanga adalah sebagai berikut :

·           Eksplan daun, batang, dan perhiasan bunga dicuci dengan deterjen dan dibilas dengan aquades steril.

·           Eksplan direndam di dalam fungisisda (benlate) 40 mg/100ml selama 5 menit dan dan dicuci dengan aquades steril.

·           Sterilisasi dengan sodium hypocloride 10% + 2 tetes tween-20 dan digojog selama 10 menit.

·           Ulangi sterilisasi dengan sodium hypoclorite 5% + 2 tetes tween-20 dan digojog selama 5 menit. Kemudian dicuci dengan aquades steril tiga kali dan digojog masing-masing satu menit.

·           Terakhir, eksplan dicelupkan dalam larutan polyvinyl pyrrolidone 50 mg/100ml.

(Hendaryono, Wijayani, 1994)

5.        Sterilisasi Biji Kedelai

Langkah-langkah sterilisasi pada biji kedelai adalah dengan merendamnya dalam alkohol 70% selama 1 menit, dipindahkan ke dalam 20% chlorox selama 15-20 menit sambil digoyang, dan kemudian dibilas menggunakan aquades steril 4x untuk menghilangkan sisas-sisa chlorox. Biji tersebut dimasukkan ke dalam aquades steril dan direndam selama 5-6 jam. Kemudian diimplan.

6.        Sterilisasi Biji Tanaman Kentang

Langkah-langkah yang dilakukan adalah, tunas dicuci bersih menggunakan deterjen dan disterilkan dalam larutan chlorox 20% selama 7 menit, direndam lagi dalam larutan chlorox 10% selama 10 menit, dibilas dengan menggunakan aquades steril.

7.        Sterilisasi Tanaman Anggrek

Langkah-langkah yang harus dilakukan dalam sterilisasi tanaman Anggrek adalah sebagai berikut :

·           Pucuk Cymbidium (Anggrek) dipotong sepanjang 3 cm. Daun-daun yang menyelubungi dibuang. Pucuck direndam dalam alkohol 70% selama 2 menit, dilakukan dua kali, dan kemudian dibilas dengan air steril.

·           Pucuk direndam ke dalam larutan chlorox 20% selama 5 menit, bilas dengan air steril 2-3 kali dan selanjutnya direndam kembali ke dalam larutan chlorox 10% selama 10 menit. Pucuk dibilas menggunakan aquades steril, selanjutnya diletakkan pada cawan petri steril.

·           Jaringan meristem yang berbentuk kubah (doMe) diambil sekitar 0,5 mm dari titik tumbuh dengan 2 calon daun. Jaringan meristem diletakkan di dalam air steril dalam cawan petri. Kemudian dipindahkan pada media dalam botol kultur.

(Yuliarti : 49-54)

Pada beberapa sterilisasi bahan(eksplan) di atas, hampir semua bahan disterilisasi dengan menggunakan chlor. Chlor adalah suatu senyawa dengan nama lain Natruim hypoklorit dengan rumus kimia (NaOCl). Larutan ini sering disebut sebagai pemutih, penawar infeksi (desinfektan), nama lainnya adalah natrium klorat. Dalam kadar rendah menghasilkan larutan hypoklorit untuk digunakan sebagai antiseptik rumah sakit yang dijual dengan nama dagang “Eusol” dan “larutan dakin” atau “Bayclin” yang diproduksi PT. Bayer Indonesia.

KESIMPULAN

            Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik. Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptik, bebas dari bakteri, jamur, yeast dan jasad renik lain pada setiap tahapan kegiatannya. Tehnik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kultur jaringan.

Kontaminasi dapat timbul pada setiap tahapan dari pelaksanaan kultur jaringan, prosedur kerja aseptis yang harus dikerjakan untuk menanggulangi kontaminasi adalah:

1. Sterilisasi ruang kerja

2. Sterilisasi medium dan alat-alat

3. Sterilisasi eksplan.

            Dan tehnik sterilisasi dapat dilakukan secara Fisik dan Kimia. Tidak semua media dan eksplan dapat disterilkan secara fisik dan kimia. Begitu juga dengan menggunakan bahan-bahan pensterilan. Semua proses sterilisasi tergantung zat ataupun bahan yang akan digunakan. Karena jika kita salah menggunakan tehnik dan proses sterilisasi yang salah maka akan mengakibatkan kerusakan pada struktur dari bahan dan eksplan itu sendiri. Sehingga dapat mengakibatkan tidak tumbuhnya eksplan walaupun tidak terkontaminasi.

            Semua tahapan yang dilakukan dalam kultur jaringan harus dilakukan secara aseptis. Hal ini guna menghindari kontaminasi oleh bakteri dan jamur. Oleh karena itu, sterilisasi eksplan ke dalam medium dilakukan di dalam laminar air flow cabinet untuk mencegah kontaminasi. Penyimpanan kultur juga harus di dalam ruangan dengan suhu, pencahayaan dan pengaturan udara yang baik.

Pada beberapa sterilisasi bahan(eksplan) di atas, hampir semua bahan disterilisasi dengan menggunakan chlor. Chlor adalah suatu senyawa dengan nama lain Natruim hypoklorit dengan rumus kimia (NaOCl). Larutan ini sering disebut sebagai pemutih, penawar infeksi (desinfektan), nama lainnya adalah natrium klorat. Dalam kadar rendah menghasilkan larutan hypoklorit untuk digunakan sebagai antiseptik rumah sakit yang dijual dengan nama dagang “Eusol” dan “larutan dakin” atau “Bayclin” yang diproduksi PT. Bayer Indonesia.

DAFTAR PUSTAKA

Ansel, H, 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi keempat. Jakarta: UI Press

Hendaryono, Wijayani, 1994, Tehnik Kultur Jaringan, Yogyakarta : Kanisius

Lachman, L, dkk, 1986, Teori dan Praktek Industri Farmasi Third Edition. Philadelphia : Lea and Febiger.TEKNIK ASEPTIK

I.       Pendahuluan

            Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali. Konsep awal dari kultur jaringan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril.

Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Sterilisasi pada teknik kultur jarngan meliputi: Sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat dan media dan sterilisasi bahan tanam. Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan pun harus dalam kondisi aseptic. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut mutlak dilakukan terutapa pada ruang penabur atau tempat yang digunakan untuk penanaman eksplan.

Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptik, bebas dari bakteri, jamur, yeast dan jasad renik lain pada setiap tahapan kegiatannya. Tehnik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kultur jaringan. Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Hambatan utama keberhasilan pelaksanaan kultur jaringan adalah adanya kontaminasi yang dapat timbul baik selama prosedur tersebut dikerjakan maupun selama kultur dipelihara didalam ruang inkubator. Kontaminasi oleh mikroorganisme menjadi problem yang sangat serius, karena mikrobia kontaminan akan segera mengkonsumsi zat hara yang ada pada medium kultur.

Mikroorganisme ini meskipun berukuran sangat kecil, tetapi jumlahnya sangat banyak dan aktivitas metabolismenya sangat tinggi, jika pertumbuhannya tidak dapat dicegah maka dalam waktu yang relatip singkat segera mendominasi kultur. Sel dan jaringan tanaman yang dikulturkan akan mati, matinya eksplan dapat disebabkan karena dibebaskanya senyawa-senyawa toksik sebagai hasil metabolisme dari mikrobia kontaminan, dapat juga karena eksplannya "dimakan" oleh mikrobia kontaminan tsb.

Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang menempel di permukaan eksplan. Peralatan yang akan digunakan untuk kultur jaringan harus sisterilkan terlebih dahulu.

Kontaminasi dapat timbul pada setiap tahapan dari pelaksanaan kultur jaringan, prosedur kerja aseptis yang harus dikerjakan untuk menanggulangi kontaminasi adalah:

1. Sterilisasi ruang kerja

2. Sterilisasi medium dan alat-alat

3. Sterilisasi eksplan.

II.      Pembahasan

STERILISASI RUANG KERJA, MEDIUM, ALAT-ALAT DAN EKSPLAN

Sebagaimana telah diuraikan pada Pokok Bahasan Laboratorium Kultur Jaringan, kegiatan aseptis dimulai didalam Ruang Steril dan Ruang Inkubasi /Kultur, kegiatan utama yang dilakukan meliputi sterilisasi dan penanaman eksplan diatas atau didalam medium kultur. Laboratorium sederhana setidaknya mempunyai dua ruangan tersebut, yang kebersihannya senantiasa harus diperhatikan. Ruang kerja yang kotor, akibat terlalu banyak orang yang lalu lalang didalamnya, dapat mengundang timbulnya kontaminasi. Ruang kultur yang tidak terpelihara dapat mengundang serangga-serangga kecil untuk masuk kedalam botol-botol yang berisi medium kultur.

Serangga-serangga kecil ini menimbulkan permasalahan tersendiri karena spora-spora jamur dan bakteri biasanya ikut lerbawa masuk kedalam botol kultur. Ruang kerja harus mudah dibersihkan dan dilengkapi dengan AC sehingga senantiasa kering dan sejuk.

Kegiatan sterilisasi medium dan alat-alat dikerjakan diruang persiapan. Kebersihan dan organisasi laboratorium yang efisien, ditunjang dengan peralatan yang memadai, dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali.

Sterilisasi ruang kerja

Ruang kerja yang digunakan untuk pekerjaan aseptis adalah ruang steril, ruangan ini harus senantiasa bersih, dinding dan lantai bersihkan setiap pagi dengan zat anti kuman / desinfektan. Udara didalam ruangan disterilisasi dengan lampu Ultra Violet (UV) yang kekuatannya disesuaikan dengan besarnya ruangan yang dipakai, lampu ini hanya dinyalakan jika ruangan tidak dipakai dan harus dimatikan ketika digunakan untuk bekerja. Radiasi UV tidak berbahaya bagi manusia karena tidak mengion, namun demikian harus diwaspadai karena dapat mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa tirnin pada satu rantai DNA. Penetrasi sinar UV utamanya pada bagian superfisial dari jaringan sehingga dapat melukai kulit dan retina mata.

 Sinar UV dapat menghasilkan ozon sehingga peneliti yang akan bekerja haras menunggu 15-30 menit setelah UV dimatikan, maksudnya supaya ozon tidak terhirup. Peneliti yang akan bekerja didalam ruangan ini haras memakai jas lab, masker dan tutup kepala, juga harus mencuci tangan dengan sabun antiseptik,kalau perlu menggunakan sarung tangan dari karet. Didalam ruangan ini terdapat alat-alat yang dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali, antara lain Laminar Air Flow dan stenl box (entkas).

·         Laminar air flow (laf).

Alat ini sangat baik dan efisien, namun harganya relatip mahal untuk menciptakan atmosfer yang steril dimana pekerjaan-pekerjaan aseptis haras dilakukan. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan hembusan udara yang sudah disaring (lihat gambar 1).

Gambar 2.1. Laminar air flow dengan bagian-bagiannya (a) udara masuk (b) blower (c) HEPA filter (d) ruang kerja aseptis (e) prefllter.

Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (high efficiency particulate air) filter dengan porositas 0,22 μm, spora-spora jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluar sudah suci hama, laf kadang-kadang dilengkapi dengan UV. Sebelum mulai bekerja, permukaan meja kerja laf disemprot dan dilap dengan kain yang telah dibasahi alkohol 70% atau spiritus, semua alat-alat dimasukkan ruang kerja (lihat gambar 2.2 detail ruang kerja).

Alat-alat dan medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya, untuk botol kultur yang berisi media, permukaannya disemprot atau dilap dengan alkohol 70%. Untuk laf yang dilengkapi dengan UV, sebelum bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan kontaminan pada permukaan ruang kerja.

Gambar 2.2 Detail ruang kerja dan Laminar air flow, botol berisi medium kultur dan alat-alat harus diletakkan dikanan kiri ruang kerja dan tidak boleh menghalangi hembusan udara steril.

Didalam laf juga sering dilengkapi dengan instalasi gas yang diperlukan untuk sterilisasi alat-alat dengan pembakaran, tetapi ini dapat diganti dengan lampu spiritus atau baktisinerator.

·         Steril box (entkas)

Alat lain untuk dapat menciptakan ruang kerja yang steril dengan harga yang relatip murah adalah steril box (entkas). Alat ini berujud seperti kotak yang terbuat dari bahan kaca (lihat gambar 4.3 ), plywood, papan kayu atau yang lebih sederhana misalnya dari kardus yang didalamnya dilapisi aluminum foil. Steril box atau entkas dapat dibuat dengan ukuran sesuai dengan yang dikehendaki, yang penting untuk diperhatikan adalah tangan kita dapat menjangkau setiap dinding entkas karena akan memudahkan untuk membersihkannya.

Gambar 2.3. Steril box (entkas) yang terbuat dari bahan kaca

Sebelum mulai bekerja, dinding entkas dibersihkan lebih dahulu dengan melap kain yang sudah dibasahi alkohol 70%. Ruang kerja didalam entkas disterilisasi dengan formalin tablet yang ditaruh didalam cawan porselin kecil dan diletakkan disudut-sudut ruangan, setiap cawan berisi satu tablet. Uap formalin ini dapat mensterilkan udara yang terdapat didalam entkas. Alat-alat dan botol kultur yang berisi media disemprot permukaannya satu persatu dengan alkohol 70% kemudian dimasukan kedalam entkas, dibiarkan 30 menit baru mulai bekerja.

 Pada entkas juga dapat ditambahkan lampu UV, entkas ini seluruh dinding luarnya harus ditutup dengan aluminum foil, hal ini diperlukan untuk menghindari mata dan kulit dari bahaya radiasi UV.

·         Sterilisasi media dan alat-alat

Media yang digunakan adalah untuk menumbuhkan eksplan. Media yang mengandung bahan-bahan yang tahan panas sterilisasinya dilakukan dengan pemanasan basah, menggunakan alat yang namanya autoclave, bekerjanya dengan tekanan uap. Standar teknis untuk Sterilisasi ini adalah pada temperatur 121°C, tekanan antara 15 - 17 psi dengan waktu antara 15-40 menit tergantung dari banyaknya media yang disterilisasi. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, sterilisasi dilakukan dengan tekanan 15 psi selama 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama.

Autoclave yang digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang paling sederhana sampai yang dapat diprogram (programmable). Autoclave sederhana pemanasan airnya menggunakan kompor gas, sedangkan pengaturan suhu tekanan dan waktunya dilakukan secara manual. Pada waktu mengoperasikan autoclave ini, jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum udara yang ada didalam autoclave diganti seluruhnya oleh uap air yang mendidih sehingga akan tercapai temperature 121°C ( langkah ini tidak dikerjakan untuk autoclave yang programmable).

Setelah waktu Sterilisasi selesai (15-20 menit) klep-klep pembuang dibuka pelan-pelan, tekanan uap didalam autoclave pelan-pelan akan sama dengan tekanan atmosfer, pembukaan klep pembuang yang tergesa-gesa akan mengakibatkan medium yang ada didalam botol kultur mendidih dan meluap. Alat lain yang mempunyai prinsip kerja mirip dengan autoclave adalah pressure cooker, alat yang biasa digunakan untuk memasak didapur ini kapasitasnya sangat terbatas, sehingga tidak dianjurkan untuk pekerjaan pada skala laboratorium karena tidak efisien.

 Autoclave yang paling modern adalah yang programmable, dapat diatur waktu, suhu dan tekanannya secara automatis sehingga dapat dijalankan sambi! mengerjakan pekerjaan yang lain.

Tabel 2.1. Lama waktu minimal untuk sterilisasi media

 (Biondi dan Thorpe, 1978)

Sterilisasi medium kultur dengan menggunakan autoclave mempunyai banyak kelemahan, antara lain:

1. Sukrosa akan terurai menjadi fruktosa dan glukosa

2. Penggunaan temperatur yang tinggi pada autoclave dapat mengakibatkan terbentuknya caramel gula yang berwarna coklat, merupakan racun didalam medium kultur

3. Sejalan dengan lamanya waktu sterilisasi, pH medium dapat mengalami perubahan, terjadi pengendapan garam-garam dan depolimerisasi agar.

Beberapa komponen medium ada yang tidak stabil kalau kena panas yang tinggi, misalnya GAs, Ca-panthothenate dan Thiamin-HCl harus disterilisasi dengan ultra filtrasi (Millipore filter) pada suhu ruangan (25°C). Dengan memakai ultrafiltrasi larutan yang berisi bahan-bahan yang termolabil dimasukkan kedalam medium kultur yang telah steril, langkah ini dikerjakan didalam ruang steril (laf) ketika medium agar telah agak dingin tetapi belum memadat.

Ada beberapa macam Millipore filter, yang terbuat dari polyethylene film sekali pakai terus dibuang (disposable), ada Millipore filter yang dilengkapi dengan holder , filter holder ini dapat disterilisasi dengan autoclave (autoclavable). Porositas dari filternya juga bermacam-macam, mulai dari 0,22 - 0,45 μm. Untuk larutan termolabil dalam jumlah sedikit (5-50 ml) dengan mudah dapat disterilisasi dengan Millipore filter yang dipasang pada ujung syrink (alat suntik). Dalam jumlah besar (50 - 5000 liter) sterilisasi dengan ultrafiltrasi ini harus dibantu dengan pompa vakum.

Alat-alat yang digunakan didalam ruang steril antara lain : scalpel, pinset bermacam-macam ukuran, petridish, cork borrer, pipet, alat-alat gelas (botol kultur dsb), gunting, kertas saring dsb. Alat-alat tersebut, sebelum disterilisasi, dibersihkan terlebih dahulu kemudian dibungkus rapi dengan kertas coklat. Alatalat yang akan disterilisasi dengan autoclave tidak boleh dibungkus dengan aluminum foil sebab uap air tidak dapat masuk kedalam bungkusan. Untuk botol kultur, sebelumnya harus dicuci kemudian ditutup dengan aluminum foil atau

bahan lain yang terbuat dari karet, kain atau plastik yang tahan panas. Botol kultur dengan penutup yang berulir, tidak boleh ditutup terlalu rapat ketika disterilisasi, ini diperlukan agar tidak terjadi perbedaan tekanan dengan ruangan didalam autoclave, perbedaan tekanan akan mengakibatkan pecahnya botol kultur.

·         Sterilisasi eksplan

Eksplan adalah bagian kecil dari tanaman baik itu sel, jaringan, ataupun organ yang digunakan untuk memulai suatu kultur. Eksplan yang digunakan didalam kultur jaringan harus yang masih muda (primordia), sel-selnya masih bersifat meristematik. Sel-sel yang bersifat meristematik dicirikan dengan sifatnya yang selalu membelah, selnya berukuran kecil tetapi inti selnya relatip besar, penuh plasma, vacuola kecil-kecil, dinding sel tipis terdiri dari dinding primitip yang berupa selulosa microfibril. Bagian tanaman yang bersifat meristematik antara lain terdapat pada ujung (kuncup) batang atau akar, dikenal dengan nama

meristem apikal, pada batang disebut shoot apical meristem sedangkan meristem yang terdapat pada kuncup diketiak daun disebut meristem aksiler (gambar 2.4).

Gambar 2.4. Tanaman dikotil dengan kuncup apikal dan aksiler dimana didalamnya terdapat sel-sel yang meristematik.

Bagian tanaman yang bersifat meristematik seringkali terdapat dalam keadaan terbuka sehingga kotoran dan berbagai kontaminan seringkali menempel pada bagian permukaannya. Kontaminan ini dapat berupa bakteri, jamur dan spora-sporanya, serangga dan telur-telurnya, protozoa dsb. Keadaan ini terutama dijumpai pada tanaman donor yang tumbuh dilapangan.

Kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptis yang terkendali, jika kontaminan ini tidak dihilangkan maka medium yang mengandung banyak nutrisi akan dengan cepat dipenuhi oleh mikrobia kontaminan tersebut. Untuk mengurangi adanya kontaminan pada permukaan eksplan, tanaman donor sebaiknya ditanam didalam rumah kaca. Pada beberapa jenis tanaman seperti ketimun dan umbi akar wortel, seringkali dijumpai adanya kontaminan internal yang terdapat didalam jaringan tanaman. Kontaminan internal ini sangat sulit untuk diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak akan efektip.

Eksplan yang digunakan ukurannya sangat bervariasi dari yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikroskopis) misalnya mikrospora, shoot apical meristem, embrio dsb sampai yang berukuran 1 cm atau lebih misalnya ruas batang, daun, hipokotil, biji, rhizom dsb. Bagian-bagian tanaman tersebut seringkali masih tertutup oleh jaringan / sarung-sarung daun misalnya pada daun tebu, hal ini akan memudahkan prosedur sterilisasi karena secara alamiah bagian daun yang ada didalamnya masih suci hama.

Eksplan yang berukuran terlalu besar akan membawa resiko kontaminasi yang lebih besar, namun jika digunakan eksplan yang terlalu kecil pertumbuhan dan respon yang diharapkan juga tidak sebaik jika menggunakan eksplan yang berukuran besar. Dilema ini menyebabkan tidak adanya metoda sterilisasi eksplan yang baku untuk semua tanaman. Hal penting yang harus diperhatikan pada sterilisasi eksplan adalah bahwa eksplan dan mikrobia kontaminan keduanya adalah jasad hidup, kontaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan eksplan.

Bahan pensteril yang umum digunakan untuk sterilisasi eksplan adalah calcium hypochlorite , sodium hypochlorite, sublimat/mercuric chloride (HgCl2), alkohol dsb. Konsentrasi dan lama waktu sterilisasi sangat bervariasi tergantung dari jenis eksplan dan tempat tumbuhnya. Eksplan yang ditumbuhkan dalam rumah kaca relatip lebih bersih, sedangkan yang berasal dari lapangan pada umumnya lebih kotor, lebih terkontaminasi sejak dari awalnya sehingga prosedur sterilisasi harus dibuat lebih keras dengan meningkatkan konsentrasi bahan pensteril atau dengan memperpanjang waktu sterilisasi.

Semua bahan-bahan pensteril adalah toksik terhadap eksplan, sehingga perlu dilakukan pencucian yang berulang-ulang agar semua bahan pensteril yang menempel dapat tercuci. Untuk meningkatkan penetrasi bahan pensteril, seringkali ditambahkan 1 atau 2 tetes agensia pembasah ( Triton-X , Tween 20 atau Tween 80) yang fungsinya menambah tegangan pada permukaan eksplan. Penggunaan pompa vakum juga dapat meningkatkan penetrasi bahan pensteril pada permukaan jaringan sehingga dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi.

Tabel 2.2 Efektifitas beberapa bahan pensteril

Bhojwani & Razdan, (1983)

Pra-sterilisasi dengan mencuci eksplan menggunakan sabun/detergent dan dibiarkan beberapa saat dibawah pancuran air yang mengalir selama 15-30 menit juga diperlukan untuk memecah koloni kontaminan agar lebih peka terhadap bahan pensteril. Bahan yang sudah bersih dikecilkan ukurannya kemudian dibawa kedalam ruang steril untuk disterilisasi lebih lanjut. Untuk sterilisasi eksplan kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan pensteril, misalnya direndam didalam larutan sodium hypochlorite kemudian dicuci dengan air steril dilanjutkan dengan perendaman didalam larutan sublimate dan pembilasan dengan air steril.

            Untuk eksplan yang berdaging (umbi kentang, wortel), eksplan yang tertutup sarung daun (pucuk tebu), dan biji muda yang masih terdapat didalam buah (anggrek) dapat disterilisasi dengan merendam didalam alkohol beberapa saat, kemudian dilewatkan diatas nyala api dan dibiarkan sampai nyala api padam, cukup efektif untuk membawa kultur bebas dari kontaminasi.

JENIS-JENIS STERILISASI

Menurut Tim Penyusun Praktikum Mikrobiologi tahun 2011, sterilisasi ada dua jenis yaitu:

1. Sterilisasi dengan cara fisik

 A. Pemanasan Air dan uap adalah media panas yang baik.

 Dalam waktu relatif singkat, alat yang akan disterilkan akan mencapai suhu yang diinginkan. Udara adalah penyalur panas yang kurang baik. Oleh karena itu, untuk mecapai suhu yang diinginkan akan membutuhkan waktu yang cukup lama.

1. Panas kering.

Cara ini untuk membunuh mikroba hanya memakai udara panas kering yang tinggi. Sterilisasi panas kering dibedakan atas :

a. Panas membara Dengan jalan menaruh benda yang akan di sterilkan dalam nyala api bunsen sampai merah membara. Alat yang disterilkan yaitu sengkelit, jarum, ujung pinset dan ujung gunting.

b. Melidah - apikan Dengan melewatkan benda dalam api bunsen, namun tidak sampai menyala terbakar. Alat yang disterilkan yaitu scalpel, kaca benda, mulut tabung dan mulut botol.

c. Udara kering Oven merupakan ciri umum yang dimaksud. Alat ini terbuat dari kotak logam, udara yang terddapat di dalamnya mendapat udara panas melalui panas dari nyala listrik. Alat yang disterilkan yaitu tabung reaksi, cawan petri, pipet, scalpel dari logam, gunting dan botol. Pemanasan satu jam dengan temperatur 160 oC paling cepat 1 jam tapi lebih baik 2 jam. Suhu ini digunakan secara khusus untuk sterilisasi minyak lemak atau cairan anhidrat lainnya.

2. Panas Basah.

Yang dimaksud panas basah adalah pemansan menggunakan air atau uap air. Uap air adalah media penyalur panas yang terbaik dan terkuat daya penetrasinya. Panas basah mematikan mikroba. Oleh karena koagulasi dan denaturasi enzim dan protein protoplasma mikroba. Untuk mematikan spora diperlukan panas basah selama 15 menit pada suhu 121 oC. Sterilisasi panas basah dapat dibedakan atas tiga golongan yaitu:

a. Panas basah <100 oC (Pasteurisasi).

Pasteurisasi yaitu pemanasan pada suhu 60 oC selama 30 menit. Pasteurisasi tidak dapat membunuh spora atau dipanaskan pada suhu 71,6 – 80 oC selama 15 – 30 detik kemudian cepat – cepat didinginkan.

b. Panas basah pada suhu 100 oC.

Di sini menggunakan air mendidih (suhu 100 oC) selama 10 menit. Untuk mematikan bentuk spora dilakukan pemansan 3 hari berturut – turut selama 15 – 45 menit sehingga spora yang tidak mati pada pemanasan pertama akan beruah menjadi bentuk vegetatif pada hari kedua steleh inkubasi pada shu 37 oC begituu pula spora yang tidak mati pada hari kedua, akan berubah menjadi bentuk vegetatif pada hari ketiga.

Metode ini jarang memuaskan untuk larutan yang mengandung bahan-bahan karena spora sering gagal tumbuh di bawah kondisi ini, bentuk vegetatif dari kebanyakan bakteri yang tidak membentuk spora,.

c. Panas basah >100 oC.

Sterilisasi dengan cara ini hasilnya mutlak steril, sehingga biasa dipergunakan di rumah sakit dan laboratorium besar. Cara ini menggunakan tangki yang diisi dengan uap air yang disebut autoclave. Alat yang disterilkan adalah alat dari kaca, kain kasa, media pembenihan, cairan injeksi, dan bahan makanan. Kerugian yang paling prinsip dari penggunaan uap ini adalah ketidaksesuaiannya untuk penggunaan bahan-bahan sensitif. Dalam waktu ½ menit pada suhu 120 oC dapat menghancurkan spora vegetatif yang tahan terhadap pemanasan tinggi.

B. Filtrasi / Penyaringan

Penyaringan dilakukan dengan mengalirka larutan melalui suatu alat penyaringan yang memiliki pori – pori cukup kecil. Untuk menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan yang umum digunakan tidak dapat menyaring virus. Penyaringan dilakukan dengan untuk mensterilkan cairan yang tidak tahan terhadap pemanasan dengan suhu tinggi seperti : serum, larutan yang mengandung enzim, toksin kuman, ekstrak sel, antibiotik dan asam amino.

Terdapat beberapa macam filter :

1. Filter seitz, digunakan dari bahan asbes yang dijepitkan pada dasar wadah besi, keuntungan dari filter ini adalah lapisan filter yang dapat di buang setelah digunakan dan masalah pembersih hanya berkurang. Filter ini mampu dengan volume dari 30 ml hingga lebih dari 100 ml, kerugian pertama dari filter ini adalah cenderung memberikan komponen magnesium pada filtrat kedua permukaan saat lapisan filter membuat larutan tidak cocok untuk injeksi.

2. Filter swinny, filter ini mempunyai alat khusus yang terdiri dari lapisan asbes, bersama dengan screen dan pencuci, utamanya untuk digunakan filter swinny dibungkus dengan kertas dan di autoclaf. Bagian yang dipasang dihubungkan pada spoit luer lola dan cairan dimasukkan melalui disk asbes dengan menggunakan tekanan pada saluran spoit.

3. Filter fritted-glass, disusun dari dasar serbuk, tombol bulat dari gelas digabung bersama dengan penggunaan panas untuk menentukan sebelumnya ukuran dalam bentuk disk.

4. Filter Berkefeld dan Mendler,  tes bentuk tube filter pembanding ini yang dihubungkan dengan dasar logam dan saluran keluar tube adalah sama pada keduanya. Dibuat dari silikat murni, asbes dan kalsium sulfat.

C. Radiasi / Penyinaran

Sinar ultraviolet umumnya digunakan untuk mengurangi kontaminasi di udara dan pemusnahan selama proses di lingkungan, aksi letal ketika sinar UV melewati bahan, energi bebas ke elektron orbital dalam atom-atom dan mengubah ke area kereaktifannya. Mikroorganisme dapat dibunuh dengan penyinaran yang memakai sinar ultrraviolet yang panjang gelombangnya antara 220 – 290 nm. Radiasi paling efektif adalah 253,7 nm. Sinar matahari langsung mengandung sinar ultraviolet 290 nm, sehingga sinar matahari adalah sinar yang bersifat bakterida yang baik.

2. Sterilisasi Dengan Cara Kimia

Zat kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi dapat berwujud :

a. Gas : Ozon, formaldehyde, ethylene oxide gas

b. Larutan : deterjen, yodium, alcohol, peroksida fenol, formalin, AgNO3 dan merkuroklorid.

            Sterilisasi dengan cara kimia antara lain dengan disenfektan. Daya kerja antimikroba disenfektan ditentukan oleh konsenntrasi, waktu dan suhu. Beberapa contoh desinfektan yang digunakan antara lain : Desinfektan lingkungan misalnya :

1. Untuk permukaan meja : lisol 5%, formalin 4% dan alcohol.

2. Untuk di udara : natrium hipoklorit 1%, lisol 5% atau senyawa fenol lain

3. Desinfektan kulit atau luka : dicuci denngan air sabun, providon yodium dan etil alkohol 70%.

KEUNTUNGAN DAN KERUGIAN MASING-MASING METODE STERILISASI

1.Sterilisasi Panas Kering

Keuntungan:

1.Dapat digunakan untuk membunuh spora dan bentuk vegetatifnya dari semua mikroorganisme (Lachman: 1263).

2. Umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif disterilkan dengan uap air panas (Ansel: 413).

3. Metode pilihan bila dibutuhkan peralatan yang kering atau wadah yang kering seperti pada zat kimia kering atau larutan bukan air (Ansel: 414).

Kerugian:

1. Hanya digunakan untuk zat-zat yang tahan penguraian pada suhu diatas kira-kira 140oC (Lachman: 1263).

2. Karena panas kering efektif membunuh mikroba dengan uap air  panas, maka diperlukan temperatur yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang (Ansel: 413).

2. Sterilisasi Uap Panas

Keuntungan :

1. Adanya uap air dalam sel mikroba menimbulkan kerusakan pada temperatur yang relatif rendah daripada tidak ada kelembaban (Ansel: 412).

2. Metode ini digunakan untuk sediaan farmasi dan bahan-bahan yang dapat tahan terhadap temperatur yang digunakan dan  penembusan uap tetapi tidak timbul efek yang tidak dikehendaki akibat uap air (Ansel : 413).

3. Sel bakteri dengan kadar air besar umumnya lebih mudah dibunuh (Ansel : 413).

4. Dipergunakan untuk larutan jumlah besar, alat-alat gelas,  pembalut operasi dan instrument (Ansel :413).

5. Dapat membunuh semua bentuk mikroorganisme vegetatif (Scoville`s : 408).

Kerugian :

a. Tidak digunakan untuk mensterilkan minyak-minyak lemak, sediaan berminyak dan sediaan yang tidak dapat ditembus oleh uap air atau pensterilan serbuk terbuka yang mungkin rusak oleh uap jenuh (Ansel : 413).  

b. Spora-spora yang kadar airnya rendah, sukar dihancurkan (Ansel : 413).

3. Sterilisasi Gas

Keuntungan :

1. Beberapa senyawa yang tidak tahan terhadap panas dan uap dapat disterilkan dengan baik dengan memaparkan gas etilen oksida atau propilen oksida bila dibandingkan dengan cara lain (Ansel : 416)

2. Dapat digunakan untuk membunuh mikroorganisme dan spora lain (Parrot : 280).

Kerugian         :

1. Gas-gas (etilen dan propilen oksida) mudah terbakar bila tercampur dengan udara (Ansel : 417)

2. tindakan pengemasan yang lebih besar diperlukan untuk sterilisasi dengan cara ini daripada dengan cara lain karena waktu, suhu kadar gas dan kelembapan jumlahnya tidak setegas seperti sterilisasi panas kering dan lembap panas (Nasel : 417)

3. Gas-gas sulit hilang dan kebanyakan bahan-bahan setelah pemaparan (Lachman:1283)

4. Iritasi jaringan dapat terjadi jika etilen oksida tidak dihilangkan sama sekali, sifat karsinogenik dan mutagenic dari etilen oksida dari sisa-sisa pada bahan yang digunakan pada manusia (Lachman : 1285).

5. Waktu siklus untuk sterilisasi dengan etilen oksida agak lama (Lachman : 1286)

4. sterilisasi Dengan Penyaringan

Keuntungan     :

1. Penyaringan dapat digunakan untuk memisahkan partikel termasuk mikroorganisme dari larutan gas tanpa menggunakan panas (Lachman : 1285)

2. Saringan tidak harus mengubah larutan/gas segala cara (Lachman : 1265)

3. Tidak menghilangkan bahan yang diinginkan atau membawa komponen yang tidak diinginkan (Lachman : 1265)

4. Kecepatan penyaringan sejumlah kecil larutan, kemampuan untuk mensterilkan secara efektif bahan tahan panas (Ansel : 416)

5. Peralatan yang digunakan relatif tidak mahal dan mikroba hidup dan mati serta partikel-partikel lengkap semua dihilangkan dari larutan (Ansel : 416)

Kerugian         :

1. Penyaringan cairan dengan volume besar akan memerlukan waktu yang lebih lama terutama bila cairan kental dibandingkan dengan bila memakai cara sterilisasi lembap panas (Ansel : 414).

2. Cara ini diharuskan menjalani pengawasan yang ketat dan memonitoring karena efek hasil penyaringan dapat dipengaruhi oleh banyaknya mikroba dalam larutan (Ansel : 414)

3. Filter bakteri tidak efektif menghilangkan virus dari larutan (Scoville’s : 419)

4. Muatan dalam pH yang sesuai yang bersifat alkali menyebabkan keusakan filter dan partikel yang kecil merupakan problem yang khusus (Scoville’s : 419)

5. Tiap kebocoran yang mungkin terjadi pada sistem ini menyebabkan kerusakan pada bagian luar tanpa kontaminan filtrat yang steril (Lachman : 1282-1283).

6. Kesulitan mempertahankan kondisi aseptis seperti merupakan masalah besar sehubungan dengan sterilisasi melalui penyaringan (Lachman : 1283)

5. STERILISASI RADIASI

Keuntungan     :

            Pemakaian radiasi meningkat dalam frekuensi dan luasnya pemakaian setelah diperoleh pengalaman dengan metode ini, khususnya untuk sterilisasi alat medis, plastik, sejumlah vitamin, antibiotik, dan hormon dalam keadaan kering setelah berhasil dibuat steril dengan radiasi (Lachman : 1276)

Kerugian         :

1. Penggunaan tehnik ini terbatas karena memerlukan peralatan yang sangat khusus dan pengaruh radiasi dan produk-produk dan wadah-wadah (Ansel : 418).

2. sediaan farmasi dalam cairan tubuh lebih sulit disterilkan karena efek radiasi tehadap sistem zat pembawa dari jaringan obat (Lachman:1276).

APLIKASI

1.        Pengaruh tingkat sterilisasi terhadap keberhasilan proses kultur jaringan dapat kita lihat pada jurnal yang berjudul “Kultur Jaringan Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) : Pengaruh metoda Sterilisasi dan Komposisi Media” Jurnal Agronomi 9(2):99-102 oleh Myrna, N.

            Pada jurnal diketahui bahwa banyak ilmuan yang masih membiakkan jeruk nipis dengan menggunakan stek batang. Padahal dengan tehnik ini akan memberi peluang bagi tertularnya penyakit, terutama disebabkan oleh virus dari generasi ke generasi. Selain itu dengan penyetekan juga membutuhkan waktu yang cukup lama. Padahal jeruk ini memiliki nilai ekonomis yang cukup baik untuk daerah-daerah di Indonesia. Karena itu dilakukanlah tehnik Kultur jaringan terhadap perbanyakan tanaman jeruk nipis sehingga semua permasalahan diatas dapat diatasi.

Pada percobaan I

Tahapan ini dilakukan pengujian terhadap berbagai metoda sterilisasi bahan tanaman. Tanaman yang dimbil adalah eksplan pucuk tanaman jeruk nipis tanpa biji dari lapangan. Untuk memperkecil tingkat kontaminasi telah dipelihara intensif di rumah kaca dan diperlakukan dengan 0,5 g L-1 Benlate seminggu sekali selama 2 bulan.

·                Bahan Sterelisasi : Na-hipoklorit (0,1 M), Ca-hipoklorit (0,5 M) dan HgCl2 (1,0 M) dan 5,0% dilakukan perendaman 10, 20, dan 30 menit.

·                Prosedur : Pucuk bagian nodus dipotong dan direndam kemudian dikocok selama 10 menit dalam larutan 2 tetes Tween-20 per 100 mL air steril. Kemudian direndam dalam bahan sterilisasi dengan konsentrasinya selama 10, 20 dan 30 menit. Kemudian dibilas dengan air steril sampai bersih. Dalam laminar Flow Cabinet, eksplan dipotong kira-kira 1 cm dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Kemudian eksplan tadi ditanamkan pada medium pra kondisi.

·                Hasil : percobaan diatas memperlihatkan bahwa Ca dan Na-hipoklorit ternyata tidak efektif untuk digunakan dalam mensterilkan eksplan tanaman jeruk nipis asal lapangan. Hal ini terlihat pada semua eksplan pada percobaan I terkontaminasi jamur dan mati. Begitu juga dengan bahan HgCl2. Tapi bahan HgCl2 lebih baik dalam melakukan sterelisasi eksplan dengan perendaman yang lebih lama yaitu 30 menit.

Percobaan II

            Percobaan-2 ini adalah pengujian terhadap berbagai komposisi medium dasar. Bahan tanaman yang digunakan sama dengan pada percobaan I.

·           Komposisi medium dasar : MS dan MS1/2, Woody Plant Medium, B-5, LS dan SH. Masing-masing diperlakukan ulang sebanyak 10 kali.

·           Bahan eksplan yang digunakan sama seperti percobaan-1, yakni potongan nodus tunggal yang berasal dari pucuk muda.

·           Hasil : dari percobaan diketahui bahwa perlakuan beberapa komposisi media memperlihatkan adanya respon pertumbuhan yang dicirikan oleh terjadinya proliferasi kalus. Tapi media yang paling baik adalah MS dan MS1/2 sedangkan media yang keempat kurang tepat dalam pertumbuhan jeruk.

2.        Sterilisasi Umbi Wortel

Langkah-langkah sterilisasi untuk umbi wortel adalah sebagai berikut :

·           Umbi wortel dicuci bersih dengan detergen, kemudian disterilisasi secara fisik dengan pembakaran. Sebelum dibakar, umbi wortel terlebih dahulu dicelup dalam spritus sebanyak 3 kali.

·           Serilisasi dengan pembakaran ini umumnya sudah cukup, tetapi kadang-kadang umbi wortel tersebut masih perlu disterilisasi lagi dengan menggunakan 0,1 sublimat.

·           Cara sterilisasi eksplan wortel adalah sebagai berikut : umbi yang telah dibakar kemudian dikupas kulit luarnya. Pengupasan dilakukan dalam laminar air flow dalam kondisi steril. Umbi dipotong-potong selebar 2 cm dan dimasukkan dalam larutan sublimat sekitar tiga menit. Setelah itu, umbi wortel dicuci dengan air steril 3-4 kali untuk menghilangkan sisa sublimat yang masih menempel.

3.        Sterilisasi Biji Melon.

Langkah-langkah sterilisasi untuk biji melon adalah sebagai berikut :

·           Daun-daun melon yang masih muda dicuci dengan deterjen hingga bersih.

·           Sterilisasi dengan clorox 10% dan dua tetes tween 20 dan digojog selama 5 menit.

·           Cara sterilisasi lainnya dengan sublimat

·           Dibilas dengan air steril dan diulang 3-5 kali agar sterilan hilang dari permukaan daun.

Sterilisasi ini dilakukan di ruang penabur dan semuanya dalam kondisi aseptis.

4.        Sterilisasi Tanaman Kenanga

Khusus untuk tanaman kenanga dan tanaman berkayu lainnya tahap sterilisasi perlu dilaksanakan secar bertingkat untuk menjaga agar kontaminasi oleh jamur dan bakteri dapat ditekan serendah mungkin. Walaupun sudah dilaksanakan sterilisasi dengan berbagai cara, namun kadang-kadang kontaminasi tetap saja terjadi. Dalam hal ini mungkin pada eksplan tersebut telah terjadi kontaminasi internal sehingga meskipun bagian permukaan telah disterilisasi tetapi tidak efektif untuk kontaminasi yang berada di dalam sel atau jaringan tanaman.

Tahap-tahap sterilisasi terhadap tanaman kenanga adalah sebagai berikut :

·           Eksplan daun, batang, dan perhiasan bunga dicuci dengan deterjen dan dibilas dengan aquades steril.

·           Eksplan direndam di dalam fungisisda (benlate) 40 mg/100ml selama 5 menit dan dan dicuci dengan aquades steril.

·           Sterilisasi dengan sodium hypocloride 10% + 2 tetes tween-20 dan digojog selama 10 menit.

·           Ulangi sterilisasi dengan sodium hypoclorite 5% + 2 tetes tween-20 dan digojog selama 5 menit. Kemudian dicuci dengan aquades steril tiga kali dan digojog masing-masing satu menit.

·           Terakhir, eksplan dicelupkan dalam larutan polyvinyl pyrrolidone 50 mg/100ml.

(Hendaryono, Wijayani, 1994)

5.        Sterilisasi Biji Kedelai

Langkah-langkah sterilisasi pada biji kedelai adalah dengan merendamnya dalam alkohol 70% selama 1 menit, dipindahkan ke dalam 20% chlorox selama 15-20 menit sambil digoyang, dan kemudian dibilas menggunakan aquades steril 4x untuk menghilangkan sisas-sisa chlorox. Biji tersebut dimasukkan ke dalam aquades steril dan direndam selama 5-6 jam. Kemudian diimplan.

6.        Sterilisasi Biji Tanaman Kentang

Langkah-langkah yang dilakukan adalah, tunas dicuci bersih menggunakan deterjen dan disterilkan dalam larutan chlorox 20% selama 7 menit, direndam lagi dalam larutan chlorox 10% selama 10 menit, dibilas dengan menggunakan aquades steril.

7.        Sterilisasi Tanaman Anggrek

Langkah-langkah yang harus dilakukan dalam sterilisasi tanaman Anggrek adalah sebagai berikut :

·           Pucuk Cymbidium (Anggrek) dipotong sepanjang 3 cm. Daun-daun yang menyelubungi dibuang. Pucuck direndam dalam alkohol 70% selama 2 menit, dilakukan dua kali, dan kemudian dibilas dengan air steril.

·           Pucuk direndam ke dalam larutan chlorox 20% selama 5 menit, bilas dengan air steril 2-3 kali dan selanjutnya direndam kembali ke dalam larutan chlorox 10% selama 10 menit. Pucuk dibilas menggunakan aquades steril, selanjutnya diletakkan pada cawan petri steril.

·           Jaringan meristem yang berbentuk kubah (doMe) diambil sekitar 0,5 mm dari titik tumbuh dengan 2 calon daun. Jaringan meristem diletakkan di dalam air steril dalam cawan petri. Kemudian dipindahkan pada media dalam botol kultur.

(Yuliarti : 49-54)

Pada beberapa sterilisasi bahan(eksplan) di atas, hampir semua bahan disterilisasi dengan menggunakan chlor. Chlor adalah suatu senyawa dengan nama lain Natruim hypoklorit dengan rumus kimia (NaOCl). Larutan ini sering disebut sebagai pemutih, penawar infeksi (desinfektan), nama lainnya adalah natrium klorat. Dalam kadar rendah menghasilkan larutan hypoklorit untuk digunakan sebagai antiseptik rumah sakit yang dijual dengan nama dagang “Eusol” dan “larutan dakin” atau “Bayclin” yang diproduksi PT. Bayer Indonesia.

KESIMPULAN

            Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik. Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptik, bebas dari bakteri, jamur, yeast dan jasad renik lain pada setiap tahapan kegiatannya. Tehnik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kultur jaringan.

Kontaminasi dapat timbul pada setiap tahapan dari pelaksanaan kultur jaringan, prosedur kerja aseptis yang harus dikerjakan untuk menanggulangi kontaminasi adalah:

1. Sterilisasi ruang kerja

2. Sterilisasi medium dan alat-alat

3. Sterilisasi eksplan.

            Dan tehnik sterilisasi dapat dilakukan secara Fisik dan Kimia. Tidak semua media dan eksplan dapat disterilkan secara fisik dan kimia. Begitu juga dengan menggunakan bahan-bahan pensterilan. Semua proses sterilisasi tergantung zat ataupun bahan yang akan digunakan. Karena jika kita salah menggunakan tehnik dan proses sterilisasi yang salah maka akan mengakibatkan kerusakan pada struktur dari bahan dan eksplan itu sendiri. Sehingga dapat mengakibatkan tidak tumbuhnya eksplan walaupun tidak terkontaminasi.

            Semua tahapan yang dilakukan dalam kultur jaringan harus dilakukan secara aseptis. Hal ini guna menghindari kontaminasi oleh bakteri dan jamur. Oleh karena itu, sterilisasi eksplan ke dalam medium dilakukan di dalam laminar air flow cabinet untuk mencegah kontaminasi. Penyimpanan kultur juga harus di dalam ruangan dengan suhu, pencahayaan dan pengaturan udara yang baik.

Pada beberapa sterilisasi bahan(eksplan) di atas, hampir semua bahan disterilisasi dengan menggunakan chlor. Chlor adalah suatu senyawa dengan nama lain Natruim hypoklorit dengan rumus kimia (NaOCl). Larutan ini sering disebut sebagai pemutih, penawar infeksi (desinfektan), nama lainnya adalah natrium klorat. Dalam kadar rendah menghasilkan larutan hypoklorit untuk digunakan sebagai antiseptik rumah sakit yang dijual dengan nama dagang “Eusol” dan “larutan dakin” atau “Bayclin” yang diproduksi PT. Bayer Indonesia.

DAFTAR PUSTAKA

Ansel, H, 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi keempat. Jakarta: UI Press

Hendaryono, Wijayani, 1994, Tehnik Kultur Jaringan, Yogyakarta : Kanisius

Lachman, L, dkk, 1986, Teori dan Praktek Industri Farmasi Third Edition. Philadelphia : Lea and Febiger.

Myrna,N. 2010, Kultur Jaringan Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) : Pengaruh Metoda Sterilisasi Dan Komposisi Media, Jurnal Agronomi 9(2):99-102

Rahman, dkk, 2009, Sediaan farmasi Steril. Makassar : Lembaga Penerbitan Unhas

Yuliarti, 2010, Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga, Yogyakarta : Andi offset

Myrna,N. 2010, Kultur Jaringan Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) : Pengaruh Metoda Sterilisasi Dan Komposisi Media, Jurnal Agronomi 9(2):99-102

Rahman, dkk, 2009, Sediaan farmasi Steril. Makassar : Lembaga Penerbitan Unhas

Yuliarti, 2010, Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga, Yogyakarta : Andi offset